最近,北京大学未来技术学院生物医学工程系陈匡时教授课题组基于双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescence Complementation,BiFC)技术,发展了一种可以在纳米尺度下研究细胞内蛋白质相互作用的新型成像技术。该技术克服了传统BiFC技术易产生假阳性信号的问题,并被用于在纳米尺度下解析宿主细胞重要蛋白质参与HIV-1病毒组装的工作模式。该研究成果已发表于学术期刊ACS Nano,题目为“A Background Assessable and Correctable Bimolecular Fluorescence Complementation System for Nanoscopic Single-Molecule Imaging of Intracellular Protein-Protein Interactions”。

BiFC技术是一种可在细胞内成像蛋白质相互作用的方法,其原理是将一个完整的荧光蛋白分割成两个非荧光片段,再将这两个非荧光片段分别与可能发生相互作用的两个目标蛋白连接形成融合蛋白,当目标蛋白在细胞内相互作用时,这两个非荧光片段会由于空间距离的靠近形成完整的荧光蛋白。然而,在目标蛋白不发生相互作用的情况下,两个非荧光片段也可能由于随机碰撞而自组装成完整的荧光蛋白,产生假阳性信号,这限制了BiFC技术对目标蛋白相互作用的定量研究。为了克服这一问题,陈匡时课题组开发了一种能够检测并消除这种由非荧光片段自组装产生的假阳性信号的方法,并将其命名为BAC-BiFC(Background Assessable and Correctable-Bimolecular Fluorescence Complementation)(图1)。具体来说,他们给BiFC中的一个目标蛋白连接上一个参考荧光蛋白,该参考荧光蛋白不仅可用来表征目标蛋白在细胞内的表达水平与空间分布,还使得研究者可以通过比率成像判断不同蛋白表达水平下假阳性信号的强弱,从而获得不受假阳性信号干扰的实验条件。

图1. BAC-BiFC工作原理

“通过发展新的超分辨BiFC技术,我们发现宿主细胞AGO2蛋白参与了HIV-1病毒颗粒组装的全过程,是病毒增殖不可或缺的原件。这一发现有望为HIV病毒和其他逆转录病毒的研究提供新的角度。”陈匡时表示。

在HIV-1病毒的增殖过程中,其结构蛋白Gag需要与众多宿主细胞蛋白发生相互作用以完成病毒颗粒的组装与出芽。研究者利用BAC-BiFC技术,在纳米尺度下对Gag蛋白与宿主细胞蛋白AGO2之间的相互作用进行了研究【通过结合超分辨率显微技术direct stochastic optical reconstruction microscopy(dSTORM)实现】。与前人的研究结果不同,研究者发现Gag蛋白并非只介导病毒颗粒包装固定数量的AGO2,而是在病毒组装后期招募了更多的AGO2(图2),这提示AGO2参与了HIV-1病毒颗粒组装的全过程,是病毒增殖不可或缺的原件。这一发现有望为HIV-1病毒和其他逆转录病毒的研究提供新的角度。值得一提的是,除了本工作所涉及的研究对象外,BAC-BiFC技术也具有对生命过程中其它各类蛋白质相互作用乃至其它生物分子之间的相互作用进行可视化研究的潜力。

图2. 通过超分辨率成像解析HIV-1 Gag蛋白和AGO2在细胞膜上互作,获得AGO2参与病毒颗粒组装的模型

陈匡时课题组的毛诗琦,应亚宸,马昭是这项工作的共同第一作者,课题组成员杨艳涛也在前期工作中作出贡献,陈匡时是本工作的通讯作者。该工作得到了国家重点研发计划和国家自然科学基金的支持。

来源:北京大学